一．NK 細(xì)胞與腫瘤
NK 細(xì)胞在 20 世紀(jì) 70 年代首次被確認(rèn)為一種獨(dú)特的淋巴亞型細(xì)胞，能夠在沒(méi)有預(yù)先致敏或檢測(cè)特定腫瘤抗原的情況下識(shí)別并快速殺死異常細(xì)胞，從而能夠起到抗腫瘤作用。目前，基于自然殺傷（NK）細(xì)胞的免疫療法已成為癌癥免疫療法（無(wú)論是實(shí)體瘤還是血液惡性腫瘤）中一個(gè)有前途的前沿科學(xué)研究課題。
NK 細(xì)胞是具有廣譜殺傷能力的先天性淋巴細(xì)胞，包括抗癌，抗病毒和抗移植物抗宿主?。℅VHD）功能。激活的 NK 細(xì)胞可以通過(guò)直接細(xì)胞毒性和/或產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子來(lái)殺死癌細(xì)胞。除了釋放穿孔素和顆粒酶以消除腫瘤細(xì)胞外，NK 細(xì)胞還通過(guò)膜受體 CD16 或由 Fas 配體（FasL）或 TNF 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）介導(dǎo)的凋亡途徑發(fā)揮抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性（ADCC）（圖 1）。
圖 1. NK 及CAR-NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒性機(jī)制。
1. 通過(guò) NK 膜表面的 Fc 受體 CD16 在 NK 細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞中起到重要作用，NK 細(xì)胞通過(guò)膜受體 CD16 或通過(guò) FASL 和 TRAIL 介導(dǎo)的凋亡途徑引發(fā) ADCC。2. 誘導(dǎo) NK 細(xì)胞向一種或多種 TAAs 的 BiKE 和 TRiKEs 是治療實(shí)體瘤的可行策略;3.CARs 將 NK 細(xì)胞重新定向到具有特異性抗原的腫瘤細(xì)胞上，能夠精準(zhǔn)清除腫瘤細(xì)胞。
二．不同來(lái)源 NK 細(xì)胞
體外獲得大量高純度 NK 細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)利用 NK 細(xì)胞用于臨床治療疾病的前提，目前可以從臍血，NK 細(xì)胞系，外周血，ES 細(xì)胞系以及 IPS 細(xì)胞系在體外操作獲得大量高純度 NK 細(xì)胞，并且可以通過(guò)基因操作用于產(chǎn)生 CAR-NK 細(xì)胞用于臨床治療（圖 2）。
圖 2. NK/CAR-NK 細(xì)胞的來(lái)源和生成過(guò)程。從各種來(lái)源（例如，PB、UCB、HSC、hESCs 和 hiPSCs）分離或建立的 NK 細(xì)胞可以使用表達(dá) CAR 的載體（例如慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒）進(jìn)行激活和基因修飾，然后在 NK 細(xì)胞特異性擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞因子，GMP 級(jí)制備的 NK/CAR-NK 可以用于臨床研究和治療。
各種不同來(lái)源 nk 生成體系有著各自不同的特點(diǎn)：1. 外周血來(lái)源 NK 細(xì)胞相對(duì)較容易獲得，經(jīng)過(guò)多年研究發(fā)展，目前從外周血高效擴(kuò)增可以獲得大量高純度 NK 細(xì)胞，技術(shù)體系相對(duì)成熟，但相對(duì)較低的轉(zhuǎn)染效率可能會(huì)限制了它們的使用。2.hiPSC 來(lái)源 NK 解決了 ES 細(xì)胞面臨的倫理問(wèn)題，目前從 hiPSC 體外生成 NK 細(xì)胞技術(shù)體系已經(jīng)建立，且易于基因編輯，但較低的擴(kuò)增能力限制了該技術(shù)方法在臨床上的轉(zhuǎn)化應(yīng)用；3. 從臍血 MNC 獲得高純度 NK 細(xì)胞的技術(shù)體系也比較完善，且UCB-NK 具有更大的增殖能力，第一個(gè) CAR-NK 臨床試驗(yàn)使用的就是臍血來(lái)源的 NK 細(xì)胞。雖然有爭(zhēng)議，但臍血來(lái)源 NK 細(xì)胞普遍認(rèn)為比外周血來(lái)源 NK 細(xì)胞具有較低殺傷活性。4. NK92 等細(xì)胞系來(lái)源 NK 細(xì)胞相對(duì)容易進(jìn)行培養(yǎng)和基因編輯，但存在與安全問(wèn)題相關(guān)的挑戰(zhàn)，并且它們?cè)诨剌斍氨仨氝M(jìn)行輻照阻礙了它們?cè)谑荏w內(nèi)存在的持久性。5. 最后，NK 細(xì)胞可以從 BM 或 UCB 的 CD34 陽(yáng)性細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生。這些細(xì)胞通常類(lèi)似于 PB-NK 細(xì)胞，并顯示出可清除白血病細(xì)胞和患者腫瘤細(xì)胞的能力，但分選 CD34+細(xì)胞的操作通常推高了制備成本，且體外培養(yǎng)技術(shù)難度更高。
綜上所述，雖然 NK 細(xì)胞有多種的來(lái)源，但從成本和安全性考慮，目前以從外周血和臍血來(lái)源的 NK 能夠更適合臨床應(yīng)用的預(yù)期，本文從臍血來(lái)源 NK（UCB-NK）和外周血來(lái)源 NK（PB-NK）細(xì)胞表型，分泌因子以及細(xì)胞毒性等方面進(jìn)行比較。
三．UCB-NK 和 PB-NK 細(xì)胞表型比較來(lái)自 UCB 和 PB 的 NK 細(xì)胞免疫表型的比較顯示出許多相似之處。例如，主要的 NK 細(xì)胞亞群，CD56 high 和 CD56dim 細(xì)胞在 UCB 和 PB 中以相同的比例存在。一些研究表明，NK 細(xì)胞觸發(fā)受體（Triggering Receptor）的表達(dá)，包括 CD94，殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR;CD158a / h 和 CD158b / j），NKp46 和 NKG2D 在 UCB 和 PB NK 細(xì)胞之間沒(méi)有差異，但也有一些研究表明 UCB 和 PB NK 細(xì)胞的某些細(xì)胞表面 markers 也存在顯著差異：來(lái)自 UCB 的 NK 細(xì)胞的較低比例細(xì)胞表達(dá) L-選擇素（CD62L），可能表明淋巴結(jié)歸位能力降低。同樣，許多粘附分子，包括 CD2，CD11a，CD18 和 CD54，存在于較低百分比的 UCB NK 細(xì)胞上。與 PB NK 細(xì)胞相比，更多的 UCB NK 細(xì)胞表達(dá) Toll 樣受體 4（TLR4），其介導(dǎo)對(duì)脂多糖的先天性炎癥反應(yīng)，盡管沒(méi)有研究比較這兩種 NK 細(xì)胞來(lái)源對(duì)脂多糖的反應(yīng)。一些研究人員還發(fā)現(xiàn)，較少的 UCB NK 細(xì)胞表達(dá)與終末 NK 細(xì)胞成熟相關(guān)的受體，包括 CD8 和 CD57（圖 3）。基于此，人們很容易推測(cè) UCB NK 細(xì)胞可能不如 PB NK 細(xì)胞成熟。然而，兩者的成熟度必須結(jié)合其他更多因素考慮，因?yàn)?UCB 衍生的 NK 細(xì)胞也表達(dá)相同或更高水平的效應(yīng)分子，包括穿孔素和顆粒酶 B，它們也與 NK 成熟有關(guān)。在 UCB 的淋巴細(xì)胞門(mén)內(nèi)，可以根據(jù) CD45 表達(dá)觀察到兩部分細(xì)胞。更具體地說(shuō)，UCB 包含 CD45dim 和 CD45 high 淋巴細(xì)胞群，而只有后者在成人 PB 中發(fā)現(xiàn)。CD45 表達(dá)減少的意義尚不清楚，需要做更多的工作來(lái)研究這兩個(gè)群體之間的差異。在 UCB 中可以找到許多 NK 祖細(xì)胞群，這些種群通常不存在于 PB 中。這些群包括 CD34?CD133?CD7?CD45+lin?細(xì)胞群，該群細(xì)胞用白細(xì)胞介素 IL-15 和基質(zhì)細(xì)胞（stromal cell）培養(yǎng)后可以分化成 NK 細(xì)胞。更進(jìn)一步 CD34+CD7+ 和 CD34-CD7+祖細(xì)胞（progenitor cell）在 UCB 中也更豐富，這些細(xì)胞也能夠發(fā)育成 NK 細(xì)胞。還有一些存在于 UCB 中的祖細(xì)胞群也被描述，包括 CD34?CD56?這一群貼壁細(xì)胞顯示多種不同表面 markers（CD14、CD11b、CD13 和 CD33）的異質(zhì)表達(dá)。當(dāng)這一群細(xì)胞使用 FLT-3 配體（FLT-3L）和 IL-15 培養(yǎng)時(shí)，這些細(xì)胞顯示出 CD14 的進(jìn)行性丟失，逐步表達(dá) CD56 和其他 NK 細(xì)胞受體。而 CD56 high 和 CD56dimNK 細(xì)胞亞群在 UCB 和 PB 中以大致相同的比例存在，其他 NK 細(xì)胞群，如 CD56?CD16+在 UCB 中更豐富。CD56?CD16+細(xì)胞在免疫受損宿主中以更高的頻率發(fā)現(xiàn)，包括那些患有慢性病毒感染的宿主（人類(lèi)免疫缺陷病毒和丙型肝炎。這群細(xì)胞使用 IL-2 和/或 IL-15 進(jìn)行培養(yǎng)可以逐漸表達(dá) CD56，表明它們可能是 NK 祖細(xì)胞。與此相一致，UCB 來(lái)源的 CD56-CD16+ NK 細(xì)胞具有較差的細(xì)胞毒性，但在 IL-2 或 IL-15 刺激后增強(qiáng)。更有趣的是，CD56?CD16+細(xì)胞在使用 UCB 的同種異體 HCT 后被鑒定出來(lái)，但在 BM 或 PB 移植后沒(méi)有。圖 3. UCB-NK 細(xì)胞和 PB-NK 細(xì)胞表型的差異。與 PB-NK 細(xì)胞相比，UCB-NK 細(xì)胞的 CD16，CD2，CD11a，CD18，CD62L，KIRs，DNAM-1，NKG2C，IL-2R，CD57 和 CD8 的表達(dá)水平較低，NKG2A 和 CXCR4 的表達(dá)水平較高。四．UCB-NK 和 PB-NK 分泌細(xì)胞因子比較先前比較 UCB 和 PB T 細(xì)胞的研究表明，有絲分裂原刺激后 UCB T 細(xì)胞的細(xì)胞因子包括 GM-CSF，TNF-α，IFN-γ 分泌減少。這歸因于 UCB T 細(xì)胞中 NFAT1 表達(dá)較少。雖然沒(méi)有研究解決 UCB NK 細(xì)胞中的 NFAT 水平，但與 PB NK 細(xì)胞相比，來(lái)自 UCB 的 NK 細(xì)胞也顯示出較低比例的 TNF-α 產(chǎn)生細(xì)胞。CD56 highNK 細(xì)胞是 IFN-γ 的重要來(lái)源，誘導(dǎo) NK 細(xì)胞中 IFN-γ 產(chǎn)生的一種既定方法是用 IL-12 和 IL-18 刺激。比較 IL-12 和 IL-18 誘導(dǎo)的 UCB 和 PB NK 細(xì)胞的 IFN-γ 反應(yīng)表明，來(lái)自 UCB 的 NK 細(xì)胞產(chǎn)生顯著更多的 IFN-γ。同樣，UCB-NK 細(xì)胞在 IL-12 和 IL-18 刺激后顯示出更多的 CD69 表達(dá)，表明 UCB NK 細(xì)胞在因子作用下能夠更好的激活。五．UCB-NK 和 PB-NK 細(xì)胞毒性比較許多研究表明，與 PB MNCs 相比，靜息 UCB 單核細(xì)胞（MNCs）具有較低的細(xì)胞毒性。然而，用 lL-2，IL-12 或 IL-15 刺激 UCB 和 PBMC, 誘導(dǎo)獲得的 NK 細(xì)胞殺傷能力相當(dāng)，最近使用純化的 NK 群體的研究證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。與未分離的 MNC 研究一樣，在 IL-2 和 IL-15 刺激后，純化的 UCB NK 細(xì)胞毒性可以顯著增加。使用其他細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)，包括 IL-12 或 IL-18 單獨(dú)或與其他細(xì)胞因子組合，顯示出類(lèi)似的效果（增加 UCB 細(xì)胞毒性）。因此，雖然毫無(wú)疑問(wèn)，靜息 UCB 衍生的 NK 細(xì)胞具有較低的體外細(xì)胞毒性，但它們對(duì)細(xì)胞因子刺激迅速作出反應(yīng)，導(dǎo)致與來(lái)自成人 PB 的類(lèi)似處理的 NK 細(xì)胞具有相同的細(xì)胞毒性作用。CD56 high 和 CD56dimNK 細(xì)胞亞群在功能上的不同已經(jīng)很好的被鑒定。CD56 high 和 CD56dimNK 細(xì)胞亞群百分比在 UCB 和 PB 中的 NK 細(xì)胞是相似的，比較這兩個(gè) NK 亞群的細(xì)胞毒性的研究揭示它們有相當(dāng)大的差異。純化的來(lái)自 UCB 和 PB 的 CD56 highNK 細(xì)胞具有低細(xì)胞毒性，這在 UCB 和 PB 中是相似的。但對(duì)于純化的 CD56dimNK 細(xì)胞，PB 中的 CD56dimNK 細(xì)胞相比 UCB 的 CD56dimNK 細(xì)胞顯示出明顯更強(qiáng)的殺傷作用。這也是為什么普遍認(rèn)為 UBC-NK 細(xì)胞比 PB-NK 具有更低細(xì)胞毒作用的原因。雖然上述 UCB-NK 細(xì)胞尤其是 CD56dimNK 細(xì)胞殺傷較低的原因尚不清楚，但 UCB 和 PB NK 細(xì)胞之間存在一些差異可以部分解釋這些差異。在測(cè)試 NK 細(xì)胞對(duì) K562 細(xì)胞結(jié)合殺傷的實(shí)驗(yàn)測(cè)定中，與 PB-NK 相比，UCB-NK 細(xì)胞與靶細(xì)胞的偶聯(lián)物大約少 3 倍。偶聯(lián)物的降低與 UCB NKs 的粘附分子（CD2，CD11a，CD18 和 CD54）相對(duì)較低的表達(dá)有關(guān)。對(duì) UCB NK 細(xì)胞殺傷能力較低的其他可能的機(jī)制解釋包括相對(duì)較高的抑制性受體復(fù)合物的表達(dá)，包括 CD94 / NKG2A 和/或 KIR。還有一些其他表面受體也可能通過(guò)靜息 UCB NK 細(xì)胞來(lái)減少殺傷。例如很大一部分 UCB NK 細(xì)胞會(huì)表達(dá)的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體（GITR）。有關(guān)細(xì)胞表型，細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性的研究數(shù)據(jù)支持 UCB NK 細(xì)胞與成人 PB NK 細(xì)胞不同的觀點(diǎn)。總體而言，UCB-NK 和 PB-NK細(xì)胞的研究表明，可溶性 GITR 配體（從腫瘤細(xì)胞中脫落）顯著減弱 NK 細(xì)胞毒性。盡管普遍認(rèn)為 UBC-NK 細(xì)胞比 PB-NK 具有更低細(xì)胞毒作用，但 UCB NK 細(xì)胞在細(xì)胞因子刺激后迅速獲得細(xì)胞毒性，如研究表明 UCB-NK 細(xì)胞在 IL-12 或 IL-15 刺激后迅速表達(dá) CD54，分泌與 PB-NK 一樣的穿孔素和顆粒酶。這些發(fā)現(xiàn)可能為 UCB-NK 細(xì)胞用于臨床治療奠定了理論基礎(chǔ)。綜上所述，UCB NK 細(xì)胞與 PB NK 細(xì)胞既有相似之處，也有不同之處。有關(guān)表面表型，細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性的研究數(shù)據(jù)支持 UCB NK 細(xì)胞與成人 PB NK 細(xì)胞不同的觀點(diǎn)。雖然靜息的 UCB 在殺傷中顯示出較低的細(xì)胞毒性，但這可以通過(guò)細(xì)胞因子刺激迅速糾正?？傮w而言，UCB 和 PB-NK 細(xì)胞之間的差異不能解釋為一個(gè)簡(jiǎn)單的不成熟或者細(xì)胞毒性高低的問(wèn)題。需要更多的研究才能清楚揭示這兩個(gè)來(lái)源 NK 所處的環(huán)境及其功能之間的差異，才能為更好的臨床轉(zhuǎn)化這兩種來(lái)源 NK 打下更好的基礎(chǔ)。
