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細(xì)胞凍存與復(fù)蘇避坑指南，看這篇就夠了

2024-07-26 點(diǎn)擊量：638

一,為什么要慢凍快融？

凍存細(xì)胞時(shí),細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的水會形成冰晶。如果直接將細(xì)胞凍存到-196℃的液氮中,由于凍結(jié)過程中胞外溶液中的水先結(jié)冰,使胞外溶液不斷濃縮,引起細(xì)胞電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水及蛋白質(zhì)變性等,會導(dǎo)致細(xì)胞受到機(jī)械性損傷。

在冷凍保存時(shí),細(xì)胞外環(huán)境中的水會結(jié)冰。冷卻速度的不同會導(dǎo)致細(xì)胞由于滲透脫水而發(fā)生不同程度的收縮。細(xì)胞外環(huán)境的滲透壓隨著水結(jié)成冰晶而不斷升高,冷卻速度越慢,細(xì)胞內(nèi)水分通過滲透作用移出胞的時(shí)間就越長。因此,非常緩慢的冷卻可能會導(dǎo)致細(xì)胞因過度脫水而死亡(A)。而快速冷卻(C)會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成冰晶,這會導(dǎo)致細(xì)胞在復(fù)溫時(shí)死亡。中間冷卻速度(B)則可以平衡滲透脫水和細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰形成的風(fēng)險(xiǎn),通?？梢詫?shí)現(xiàn)細(xì)胞存活率最大化。

如果在凍存液中加入保護(hù)劑(如DMS0),可使冰點(diǎn)降低,增加細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定性。減緩慢速降溫過程中的脫水皺縮現(xiàn)象,在緩慢凍結(jié)時(shí)減少冰晶的生成,使細(xì)胞免受損傷。

而在復(fù)蘇時(shí),需要快速升溫,在1-2min內(nèi)融化并稀釋,這時(shí)細(xì)胞內(nèi)外還來不及形成較大的冰晶,也不會使細(xì)胞長時(shí)間暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中,從而避免細(xì)胞損傷,提高細(xì)胞存活率。

二,細(xì)胞凍存

了解了慢凍快融的原理,還有哪些Tips可以提高凍存和復(fù)蘇的成功率呢?那么凍存細(xì)胞的最佳時(shí)機(jī)是什么時(shí)候?什么樣的細(xì)胞濃度合適?要用多少凍存液呢?怎么實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的“慢凍”呢?

①最佳時(shí)機(jī)
細(xì)胞處于對數(shù)生長期,狀態(tài)良好,且實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好,此時(shí)的細(xì)胞最適合凍存。最好在復(fù)蘇后兩周內(nèi)凍存細(xì)胞,留一部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

②凍存液
凍存液應(yīng)于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天新鮮配制。常用的細(xì)胞凍存液配方為①培養(yǎng)基:血清:DMSO=7:2:1或②血清:DMSO=9:1DMS0是最常用的冷凍保護(hù)劑,5-10%的DMS0可用于大多數(shù)細(xì)胞的冷凍保存。DMSO有吸濕性,如使用DMSO作為冷凍保護(hù)劑,應(yīng)將其儲存于干燥環(huán)境中,避免使用開封1年以上的DMS0。凍存液中加入血清有助于解凍后的細(xì)胞恢復(fù),但是隨著無血清培養(yǎng)基的廣泛應(yīng)用,需要能夠在沒有血清的情況下凍存胞,不含血清的市售凍存液也是一個(gè)很好的替代選擇。

③細(xì)胞濃度
建議細(xì)胞濃度為1x10cells/mL。根據(jù)細(xì)胞類型的不同,可擴(kuò)展至5x105~1x107cells/mL。更高的細(xì)胞濃度并不會提高解凍后的活細(xì)胞數(shù)量,反而會由于高濃度引起的堆積效應(yīng)而影響細(xì)胞活力。

④凍存液體積
常規(guī)2mL凍存管以1mL凍存體積為佳。不建議單個(gè)樣本體積過大,否則會由于各部分冷卻速度不一致而導(dǎo)致細(xì)胞活力受損。

⑤降溫速度
對于大多數(shù)細(xì)胞,-1°C/min的降溫速度能夠極大保存細(xì)胞活力?？墒褂?span style="color:#0052FF;">程序降溫盒或梯度降溫,推薦的梯度降溫步驟為4℃20min→>-20℃30min→>-80℃過夜→液氮保存,亦可選用市售非程序性細(xì)胞凍存液,可直接存放至-80°C

⑥降溫速度
短期可儲存在-80℃,長期儲存應(yīng)保存在液氮中。長期存放于-80℃可能會降低細(xì)胞活力和功能。

⑦標(biāo)記和記錄
在凍存管上清楚標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存人和凍存時(shí)間,并在記錄本上登記細(xì)胞信息以及詳細(xì)的存放位置,以便在復(fù)蘇的時(shí)候正確拿取細(xì)胞。

三,細(xì)胞復(fù)蘇

復(fù)蘇后第二天發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沒有活?好不容易復(fù)蘇的細(xì)胞竟然污染了?怎么才能讓細(xì)胞滿血復(fù)活呢?

①細(xì)胞拿取
盡量減少樣品從液氮或-80℃ 取出到放置在解凍裝置中之間被動(dòng)升溫的時(shí)間,否則會大大影響細(xì)胞活力。如果儲存裝置和解凍裝置相隔較遠(yuǎn),可使用裝有干冰(-80°C)或液氮(-196°C)的隔熱容器臨時(shí)保存和運(yùn)送細(xì)胞。(注意:從液氮中取細(xì)胞時(shí)要佩戴護(hù)目鏡和手套,謹(jǐn)防凍傷及凍存管爆炸!)

②解凍方式
a)解凍細(xì)胞時(shí)需要快速升溫(50~100℃/min)才能最大保存細(xì)胞活力,最優(yōu)的解凍方式是37℃水浴。從液氮或-80℃取出凍存的細(xì)胞后,稍擰松管蓋,防止解凍過程中凍存管炸裂。放入37℃水浴中,持續(xù)搖晃1-2分鐘直至解凍。

通常建議在可見冰融化但樣品仍然冰冷(~0℃)時(shí)立即停止解凍,常見的做法是在只剩下一小片冰時(shí)從水浴鍋中取出樣品。升溫至室溫或更高溫度會增加冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性,這會極大影響細(xì)胞活力。b)不建議室溫解凍細(xì)胞,因?yàn)檫@會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

c)為降低污染風(fēng)險(xiǎn),水浴解凍時(shí)凍存管管口要高于水面,避免水流入凍存管,水浴鍋中的無菌水也要定期更換。

③稀釋
解凍后應(yīng)盡快稀釋,以減少DMS0的細(xì)胞毒性。按照培養(yǎng)基:凍存液≥10:1的比例加入培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,然后離心并更換培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,這樣可以減少由滲透壓變化導(dǎo)致的細(xì)胞應(yīng)激。

④換液
依據(jù)細(xì)胞狀態(tài),在細(xì)胞貼壁后或24h后換液,繼續(xù)培養(yǎng)。

四,答疑

Q:為什么我復(fù)蘇的細(xì)胞完全不貼壁?
A:可能是由于細(xì)胞凍存前生長狀態(tài)差或者復(fù)蘇過程中動(dòng)作慢,因此一
定要挑選生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行凍存,操作過程要遵循“慢凍快融”的原則!

Q:為什么我復(fù)蘇細(xì)胞的時(shí)候明明已經(jīng)貼壁了,第二天再去看發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全死了？
A:可能是細(xì)胞凍存之前消化過度,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,因此消化細(xì)胞時(shí)一定要嚴(yán)格控制消化時(shí)間哦!

Q:細(xì)胞復(fù)蘇后只有非常少量細(xì)胞貼壁,是不是需要重新復(fù)蘇?
A:先不要著急丟掉!可以補(bǔ)加血清和細(xì)胞因子,或者每隔2-3天換新鮮的生長培養(yǎng)基,經(jīng)過2-3次換液后,大部分細(xì)胞就能看到明顯增殖,此時(shí)再按照正常傳代操作即可。當(dāng)然,如果細(xì)胞庫存充足,或者著急做實(shí)驗(yàn),可以重新復(fù)蘇一株細(xì)胞~

Q:凍存液配多了,不想浪費(fèi),可以留到下次用嗎?
A:配好的凍存液在4℃可以暫存1周,在-20℃最多可保存一個(gè)月。不過最好還是現(xiàn)配現(xiàn)用、避免反復(fù)凍融。