根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如鏈霉親和素等)結(jié)合，最后通過呈色反應(yīng)或熒光來顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。
1、按照標(biāo)記物的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫膠體金法及放射免疫自顯影法等。
1）免疫熒光法
將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察，當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會發(fā)出一定波長的熒光，從而可以確定組織中的抗原定位或定量。
2）免疫酶標(biāo)法
基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究
免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。
由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。
2、按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法)。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。
3、按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶(PAP)法；親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)法等，其中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測。①免疫組化的原理就是一抗結(jié)合到目標(biāo)蛋白，再有二抗來進(jìn)行信號放大。
②二抗的信號放大有多種方法，取決于二抗標(biāo)記方法的選擇，簡單的二抗標(biāo)記方法是直接法，就是直接在二抗上標(biāo)記酶，比如HRP，來進(jìn)行顯色，這樣的二抗實(shí)際上很便宜，但是缺點(diǎn)就是靈敏度低，好多低豐度的蛋白，結(jié)合不上，免疫組化染出來的效果就不太好。
③第二種方法，叫做PAP，比如二抗標(biāo)記了HRP，他們就在孵育二抗后，再孵育一種能結(jié)合HRP的一抗。這種方法靈敏度上去了，但是非特異性增高了。④第三種方法被稱為ABC法或者SABC法，主要是在二抗上標(biāo)記生物素，孵育二抗后，加入親和素以及標(biāo)記了HRP的生物素，以這樣的聚合方式，來進(jìn)行信號的放大作用。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠成倍提高靈敏度，但同時也會提高非特異性，于是就產(chǎn)生了第四種方法，LSAB法標(biāo)記的二抗：
這種方法，直接在親和素上加上HRP標(biāo)記，靈敏度也很高，同時降低了SABC法的非特異性。而且，LSAB法在實(shí)驗(yàn)的時一般孵育時間短(通常就10分鐘)。
⑤SABC法和LSAB法在實(shí)驗(yàn)過程中需要進(jìn)行內(nèi)源生物素封閉，操作復(fù)雜些，于是產(chǎn)生了第五種標(biāo)記方法，也就是Polymer法，就是在二抗上標(biāo)記聚合的HRP：這樣二抗的信號就得到了放大，靈敏度也提高了，但Polymer法、SABC法、LSAB法，都不能用于定量實(shí)驗(yàn)，只能用在IHC上。
免疫熒光主流是采用直接法、LSAB法，以及直接標(biāo)記或者LSAB標(biāo)記的三抗來進(jìn)行信號放大的?？偨Y(jié)一下，就是直接法的二抗便宜但是靈敏度差；PAP法基本已經(jīng)淘汰，LSAB和SABC法的靈敏度高，但是貴，步驟多；Polymer法靈敏度高，步驟簡單，但是貴。
a.脫蠟：60℃ 20min；二甲苯I 10min 、二甲苯II 10min。b.梯度水化：100%EtOH I 5min 、100%EtOH II 5min、95%EtOH 3min、80% EtOH 3min、70% EtOH 3min。c.滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H?O?常溫下避光孵育10min，PBS沖洗3次×3min。d.抗原修復(fù)：置0.01M枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)中用煮沸(微波爐可高火4次×6min)，自然冷卻30min以上，至室溫后PBS沖洗3次×3min。e.封閉：用封閉液(一般與二抗來源一致，如正常羊血清工作液)封閉，常溫下10~30min，傾去勿洗。f.一抗孵育：滴加適宜濃度的一抗4℃冰箱孵育過夜(最常用)，37℃復(fù)溫45min，PBS沖洗5次×3min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)。g.二抗孵育：滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30min, PBS沖洗5次×3min。h.SP反應(yīng)：滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗5次×3min。i.DAB顯色：配置DAB/H?O?反應(yīng)液孵育組織切片，鏡下控制染色，一般3~10min，自來水充分沖洗。j.蘇木素復(fù)染：一般胞漿蛋白或胞膜蛋白可以適當(dāng)染至幾十秒~幾分鐘，但細(xì)胞核蛋白在幾秒。若過染，可以用1%HCl褪色。k.常規(guī)脫水：50% ethanol 1-2min、70% ethanol 1-2min、95% ethanol 1-2min、95% ethanol 1-2min、100% absolute ethanol: (1-2)min、100% absolute ethanol: (1-2)min。l.透明：Xylene 1×(1-2)min→Xylene 2×(1-2)min；m.封片：中性樹膠。
2、免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先60℃20min，然后立即二甲苯1-3分別10min(這個時間是由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定的)，但當(dāng)天制好的切片一般先60℃ 3-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。
②抗原修復(fù)
由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種(中性的、高pH的等)。
③滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素
在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易收到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性過氧化物酶一般3%過氧化氫滅活時間短點(diǎn)，可以10min左右，而0.3%過氧化氫則可以適當(dāng)延長封閉時間，一般10~30min。
用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4℃避光保存。
④血清封閉
組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過度。
⑤一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間
一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2h，而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。
二抗孵育條件：二抗一般室溫或37℃ 30min-1h，而濃度一般有工作液?？贵w稀釋液一般就用PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗(延長時間和增多次數(shù))尤為重要。
注意：a.單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。b.溫柔沖洗(浸洗方式)，防止切片的脫落。c.沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。d.PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。(中性及弱堿性條件(PH7-8)有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解)。
⑦DAB顯色
背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時即可沖洗；DAB顯色時間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明實(shí)驗(yàn)的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短實(shí)驗(yàn)的抗體孵育時間。
此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能實(shí)驗(yàn)前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長(如超過十幾分鐘)才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明實(shí)驗(yàn)者的抗體濃度過低或孵育時間過短(最好一抗4℃過夜)；另一方面就是封閉時間過長。
⑧復(fù)染
目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染(胞核染料)。注意蘇木素復(fù)染時間要看當(dāng)時的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當(dāng)時間長一點(diǎn)，而胞核蛋白則要短。
不過這個如果染色不理想可以補(bǔ)救的。方法是：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返藍(lán)。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒(一定動作要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。
⑨脫水透明
免疫組化對標(biāo)本處理最后的脫水透明需要采用由低至高的梯度酒精脫水，是避免直接將組織投入高濃度酒精中而造成組織過度收縮。
⑩封片
為了長期保存，實(shí)驗(yàn)人員一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。
1、非特異性染色
①抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。②一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體。③內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織)，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色。④非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果。⑤DAB孵育時間過長或濃度過高。⑥PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要。⑦標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。
2、呈陰性結(jié)果
①抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最佳濃度。②抗原修復(fù)不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合。③組織切片本身這種抗原含量低。④血清封閉時間過長。DAB孵育時間過短。⑤細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。1、臨床應(yīng)用：惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；對某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型。
2、免疫組化鏡檢：定位抗體的表達(dá)部位(細(xì)胞間質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、核膜、細(xì)胞核等或表達(dá)組織)。
3、細(xì)胞凋亡檢測：正常凋亡細(xì)胞通過檢測凋亡細(xì)胞DNA片段進(jìn)行染色，正常的、人為造成凋亡的細(xì)胞很少能夠被染色。以甲基綠復(fù)染，便于從形態(tài)學(xué)上分辨評估正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。
