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預(yù)防用mRNA疫苗：脂質(zhì)納米顆粒質(zhì)量研究及質(zhì)量控制藥學(xué)評價的思考

2024-08-13 點(diǎn)擊量：630

核酸藥物發(fā)展幾十年來，遞送系統(tǒng)一直是制約其發(fā)展的主要瓶頸，而脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticle，LNP)技術(shù)的研發(fā)極大地推動了核酸藥物的發(fā)展。mRNA-LNP的制備工藝盡管工藝步驟簡單、周期較短，但短短幾分鐘內(nèi)就可能存在復(fù)雜的相變。同時，近年來脂質(zhì)材料、生產(chǎn)設(shè)備不斷發(fā)展，這些因素都增加了mRNA-LNP形態(tài)多樣化的可能，為其生產(chǎn)工藝過程控制、質(zhì)量特性研究和質(zhì)量控制帶來挑戰(zhàn)。

近年來，國內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)相繼發(fā)布了mRNA疫苗的技術(shù)指南，如國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心發(fā)布《新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》、WHO發(fā)布的“Evaluation of the quality，safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations”等，初步建立了mRNA疫苗的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。

mRNA-LNP的組成及形成機(jī)制

目前階段，預(yù)防用mRNA疫苗經(jīng)典的LNP制劑處方主要包含4種不同脂質(zhì)成分: 可電離脂質(zhì)化合物、輔助磷脂化合物、膽固醇和聚乙二醇(PEG)脂質(zhì)化合物。

可電離脂質(zhì)化合物主要作用是結(jié)合mRNA，維持mRNA穩(wěn)定并將其有效遞呈至靶細(xì)胞，同時在內(nèi)涵體逃逸過程中發(fā)揮了重要作用;
輔助磷脂和膽固醇在穩(wěn)定LNP以及提高LNP與細(xì)胞膜融合過程中發(fā)揮重要作用，膽固醇通過填補(bǔ)脂質(zhì)間的空隙增強(qiáng)LNP的穩(wěn)定性，并在細(xì)胞融合階段幫助脂質(zhì)體與體內(nèi)細(xì)胞膜融合，輔助脂質(zhì)主要發(fā)揮納米顆粒流動性的調(diào)節(jié)作用，同時也輔助與細(xì)胞膜融合的過程;
PEG脂質(zhì)化合物則主要通過均勻分布在LNP表面增強(qiáng)LNP穩(wěn)定性，且通過限制脂質(zhì)融合以控制LNP的粒徑，在體內(nèi)發(fā)揮降低血漿清除、延長體內(nèi)循環(huán)等功能。

制備mRNA-LNP一般劃分為2個生產(chǎn)階段: 首先是通過線性化的質(zhì)粒模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、加帽和純化得到mRNA原液。成品的生產(chǎn)工藝流程通常是將mRNA溶解在pH酸性的水相緩沖液中，脂質(zhì)成分按照一定的比例溶解在乙醇溶液中，有機(jī)相的脂質(zhì)混合溶液和水相的mRNA溶液按一定的流速比經(jīng)納米混合設(shè)備(微流控芯片設(shè)備或者射流混合器)混合得到mRNA-LNP包封液，包封液經(jīng)pH調(diào)節(jié)及稀釋、超濾、濃縮和無菌過濾后得到最終的mRNA-LNP成品。

如圖1所示，在mRNA-LNP形成過程中，首先在酸性緩沖溶液中脂質(zhì)乙醇溶液和mRNA水溶液進(jìn)行混合，酸性條件下可電離陽離子脂質(zhì)化合物中叔胺基團(tuán)迅速被質(zhì)子化形成帶有正電的季銨鹽結(jié)構(gòu)，與帶有負(fù)電荷磷酸基團(tuán)的mRNA通過靜電相互作用形成疏水性復(fù)合物，該復(fù)合物結(jié)構(gòu)一般為反六角相的結(jié)構(gòu)，其他脂質(zhì)成分由于其兩親的結(jié)構(gòu)特性形成膠束、囊泡等顆粒結(jié)構(gòu)，在該過程中得到的主要是一些小顆粒復(fù)合物。上述不規(guī)則的小顆粒復(fù)合物分散在含有乙醇的酸性緩沖溶液中，需要立即將LNP置于中性緩沖液中進(jìn)行稀釋和透析(或超濾)。

隨著pH值的升高，脂質(zhì)顆粒之間發(fā)生融合，各脂質(zhì)組分重新分配，可電離脂質(zhì)去質(zhì)子化使其電荷趨向中性，與mRNA的靜電結(jié)合能力下降。在水相環(huán)境中，可電離脂質(zhì)和膽固醇發(fā)生分離，在LNP內(nèi)部形成無定形的油相內(nèi)核，而雙親性的輔助磷脂和PEG脂質(zhì)在外層形成單層、雙層或者多層的殼狀結(jié)構(gòu)，最終形成一個熱力學(xué)穩(wěn)定的殼核球狀結(jié)構(gòu)。

通過mRNA-LNP形成過程，可以看出脂質(zhì)成分比例、脂質(zhì)相和水相的流速及比例、緩沖鹽種類及濃度、過程中pH控制以及稀釋純化方法都會直接影響到mRNA-LNP顆粒大小、包封率、表面電勢、顆粒形態(tài)等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

mRNA-LNP粒徑變化

LNP在生產(chǎn)及儲存過程中粒徑出現(xiàn)不均一、不穩(wěn)定且變化較大的共性問題，這也是在mRNA疫苗多年開發(fā)過程中全球聚焦的問題之一。制劑制備過程中，盡管mRNA-LNP形成的上述原理較為通用，但由于各企業(yè)制劑處方、制劑工藝及設(shè)備的不同，LNP粒徑在不同工藝階段的動態(tài)變化也會有所差異。

產(chǎn)品粒徑變化可能存在以下3種情形:

①LNP包封到成品放行檢測粒徑均無明顯變化。

②LNP自包封至半成品粒徑較為穩(wěn)定，成品放行檢測中因產(chǎn)品貯存條件原因(涉及凍融)，呈現(xiàn)粒徑明顯增大現(xiàn)象。

③在包封后的各步稀釋、pH調(diào)整步驟粒徑增大明顯，之后趨于穩(wěn)定，反復(fù)凍融對粒徑未產(chǎn)生明顯影響。

mRNA疫苗創(chuàng)新程度較高且工藝復(fù)雜，整體上多種因素可能影響mRNA-LNP顆粒形成以及顆粒的大小。目前對粒徑變化原因進(jìn)行充分分析存在挑戰(zhàn)，粒徑大小對藥品安全有效性的影響也尚需在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。但從生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性及批間一致性角度，粒徑處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)更利于質(zhì)控。

從評價角度提出如下科學(xué)建議:

①在處方和工藝研究初期開展并積累更多的粒徑-工藝參數(shù)相關(guān)性研究數(shù)據(jù)，依據(jù)相關(guān)影響因素持續(xù)優(yōu)化生產(chǎn)工藝、儲存條件等;

②對不同LNP生產(chǎn)階段工藝參數(shù)設(shè)置、LNP變化趨勢進(jìn)行深入研究，并建立適宜的內(nèi)控，主要考慮階段及因素如產(chǎn)品包封、包封后稀釋、超濾、半成品配制各步的pH控制范圍，對于pH變化較大的和/或pH接近可電離陽離子pKa的步驟，研究LNP粒徑及其分布是否改變及其變化趨勢;

③采用多種檢測方法對粒徑進(jìn)行更深入的研究，除常規(guī)的動態(tài)光散射(DLS)法，還可以采用納米顆粒追蹤分析(NTA)、電鏡計數(shù)、凝膠色譜，納米流式等方法;

④除平均粒徑外，建議積累顆粒累積分布D10，D50，D90以及總粒子計數(shù)等參數(shù)，以期達(dá)到LNP粒徑在一定條件下可以相對穩(wěn)定的目標(biāo)。

mRNA-LNP不規(guī)則形態(tài)

綜上所述，mRNA-LNP的形成和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的過程是一個由動力學(xué)控制逐漸轉(zhuǎn)為熱力學(xué)控制的過程。文獻(xiàn)報道的mRNA-LNP冷凍電鏡圖主要包含2種結(jié)構(gòu)類型，分別為無囊泡突出的單室結(jié)構(gòu)以及含有雙層囊泡突出結(jié)構(gòu)的雙室或多室結(jié)構(gòu)。

在mRNA-LNP的制備過程中，多種因素可能影響到mRNA-LNP的形態(tài)，如脂質(zhì)種類、包封過程中的流速比、從pH酸性到中性的中和以及最終的透析超濾過程使用的緩沖鹽種類及濃度等。同時，mRNA-LNP成品在長期儲存、反復(fù)凍融以及凍干復(fù)溶的過程也會引起LNP內(nèi)部脂質(zhì)、水和mRNA的重新分布，從而導(dǎo)致mRNA-LNP形態(tài)變化。

針對mRNA-LNP的顆粒形態(tài)表征方法目前主要有透射電鏡(TEM)、冷凍電鏡(cryo-TEM)、原子力顯微鏡(AFM)、小角X射線散射(SAXS)、差示掃描量熱法(DSC)、DLS、NTA等方法。其中，雖然冷凍電鏡存在僅能對局部視野進(jìn)行定性監(jiān)測、受主觀影響較大等缺點(diǎn)，但其仍是當(dāng)前顆粒形態(tài)表征中較為成熟的方法，且觀測結(jié)果也較能反映顆粒實(shí)際狀態(tài)。

目前，國內(nèi)外已上市和正在研發(fā)的mRNA疫苗LNP多為無囊泡突出的單室結(jié)構(gòu)，但也有部分研究的電鏡圖顯示其LNP顆粒極度不均一，形態(tài)各異，存在空泡和/或融合等現(xiàn)象。雖然有文獻(xiàn)報道m(xù)RNA-LNP的囊泡結(jié)構(gòu)可增加體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效力及小鼠體內(nèi)蛋白表達(dá)，但上述研究僅為實(shí)驗(yàn)室探索性研究。因現(xiàn)有臨床數(shù)據(jù)較為有限，尚無確證數(shù)據(jù)表明LNP囊泡結(jié)構(gòu)與mRNA疫苗臨床的安全性、有效性具有相關(guān)性。